在團隊確定了多器官類器官研究的方向後，張悅立即投入了肝臟類器官的研究工作。肝臟作為人體最大的實質性器官，承擔著代謝、解毒、合成等重要功能，肝類器官的成功培養將給肝硬化、肝功能衰竭患者帶來新的希望。
張悅首先梳理了現有的肝臟類器官研究文獻。“肝臟發育過程複雜，需要精確模擬胚胎肝臟發育的訊號通路。”她在實驗室會議上向團隊成員介紹，“我們需要誘導幹細胞依次經歷內胚層、前腸內胚層、肝母細胞，最終分化為成熟的肝細胞和膽管細胞。”
趙坤提出了一個關鍵問題：“肝臟包含多種細胞型別，除了肝細胞外，還有膽管上皮細胞、肝星狀細胞、庫普弗細胞等。我們是否需要培養包含所有這些細胞型別的複雜類器官？”
“這是個很好的問題，”張悅回答，“初期我們可以先專注於功能性肝細胞的培養，確保類器官具備基本的代謝和解毒功能。隨著技術進步，再逐步增加其他細胞型別，構建更完整的肝臟微環境。”
易新亮從臨床應用角度補充道：“對於肝功能衰竭患者，即使只能恢復部分肝細胞功能，也可能顯著改善他們的生存質量和預後。我們應該先解決最迫切的問題。”
研究首先從幹細胞向肝系分化開始。張悅設計了一套多階段誘導方案，透過精確控制生長因子和小分子的新增時機，引導幹細胞沿著肝系分化路徑發展。
第一階段是內胚層誘導。張悅使用了Activin A等高活性分子，成功將人多能幹細胞誘導為FOXA2和SOX17陽性的內胚層細胞。免疫熒光染色顯示，超過百分之八十五的細胞表達了內胚層標誌物。
“內胚層誘導效率不錯，”張悅記錄著實驗資料，“這是肝臟發育的起點，必須打好基礎。”
接下來是前腸內胚層和肝母細胞誘導階段。張悅添加了FGF和BMP訊號通路激動劑，促進細胞向肝系特化。顯微鏡下，細胞形態開始發生變化，逐漸呈現出上皮樣特徵。
“肝母細胞標誌物AFP和CK19開始表達，”張悅在第西天檢測時發現，“說明細胞正在向肝系定向分化。”
分化過程中最大的挑戰是促進肝細胞功能成熟。未成熟的肝細胞雖然表達肝系標誌物，但功能不完善，特別是藥物代謝酶活性較低。張悅嘗試了多種成熟促進方案，包括新增糖皮質激素、cAMP類似物等。
“我們需要類器官不僅看起來像肝臟，還要真正發揮肝臟功能。”張悅反覆最佳化培養條件。
在初步獲得肝系細胞後，張悅開始構建三維類器官。她將分化中的肝祖細胞接種在基質膠中，提供適當的三維支架環境。
“肝臟是具有複雜結構的器官，二維培養無法模擬其真實微環境。”張悅解釋著三維培養的重要性。
三維培養確實帶來了新的挑戰。類器官內部的細胞可能因為營養和氧氣供應不足而死亡，細胞極性建立也需要特定條件。張悅嘗試了不同的接種密度、培養基組成和培養器皿，尋找最佳培養條件。
經過多次最佳化，她終於獲得了結構緊密、首徑約100-200微米的肝類器官。組織切片顯示，這些類器官呈現出類似肝小葉的結構特徵。
“看這些類器官的形態，”張悅興奮地向團隊展示結果，“它們自發形成了類似肝板的排列結構，這是功能組織化的表現。”
接下來是功能驗證階段。張悅進行了一系列實驗來評估肝類器官的功能成熟度。
首先檢測白蛋白分泌功能。白蛋白是肝臟合成的最重要蛋白質之一，是肝功能的關鍵指標。ELISA檢測顯示，肝類器官持續分泌白蛋白，且分泌量隨著培養時間增加而上升。
“白蛋白分泌水平達到原代肝細胞的百分之六十，”張悅分析資料，“考慮到這是首次培養，這個結果相當鼓舞人心。”
接著是尿素合成功能測試。尿素迴圈是肝臟特有的代謝途徑，反映肝臟的解毒能力。檢測結果顯示，肝類器官能夠有效合成尿素，說明具備了基本的氨解毒功能。
最關鍵的測試是藥物代謝能力。張悅使用了常見的肝藥酶底物，檢測類器官中CYP450酶系的活性。這是評估肝臟解毒功能的核心指標。
“CYP3A4、CYP2C9、CYP2D6等主要藥物代謝酶都有活性表達，”趙坤協助進行這項檢測，“雖然活性水平還不及成熟肝細胞，但己經具備了藥物代謝的基礎能力。”
尹美秋從中醫角度觀察這些肝類器官：“肝主疏洩，這些類器官顯示出代謝和解毒功能，正是疏洩功能的體現。如果能夠移植到患者體內，應該能夠幫助恢復肝的生理功能。”
在功能測試的同時，張悅也在最佳化類器官的長期培養條件。肝臟類器官需要在體外維持較長時間，以便進行質量控制和移植前準備。
“我們需要類器官在體外至少存活西周，同時保持功能穩定。”張悅設定了一個明確目標。
透過最佳化培養基配方和培養條件，她成功將肝類器官的存活時間延長到一個月以上。更重要的是，在此期間，類器官的功能不僅沒有下降，反而隨著成熟度提高而增強。
“這很關鍵，”易新亮評價道，“說明我們的培養條件能夠支援類器官的功能成熟，而不僅僅是維持生存。”
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