東翼以淺井久政為主，分為三陣：先陣，磯野員昌八百人；二陣，海北綱親八百人；本陣，淺井久政一千人，合計兩千六百人。
中線由熊谷元直指揮，分為五陣：一陣，熊谷元直率領一千三百名常備兵加上宇野村賴等北播磨眾，總計三千人；二陣，波多野元秀率領南丹波眾約三千人；三陣，浦上政宗率領西播磨眾總計三千人；四陣，小寺政職率領東播磨眾兩千人；五陣，川勝廣繼率領北丹波眾總計兩千人，合計一萬三千人。
西翼由荻野朝綱指揮，分為兩陣：一陣，荻野朝綱率領的蘆田黨三千人；二陣，鹽見賴勝所部兩千人，合計五千人。
此外，熊谷隆直率領一千常備兵作為本陣，留守三田村城坐鎮指揮。
在聯軍研究佈陣的同時，六角軍緊趕慢趕終於抵達了武田軍正南方。面對來勢洶洶的武田軍，六角義賢認為他們長途跋涉，肯定軍士疲憊、戰力不高，因此對野戰並不擔心，六角諸將也是信心滿滿，決定與聯軍針鋒相對。
東翼，由後藤賢豐指揮，同樣分為三陣：先陣，蒲生定秀兩千人；本陣，後藤賢豐兩千人；三陣，目賀田綱清率領的愛知眾兩千人，總計六千人。
中線，由進藤貞治指揮，分為四陣：一陣，香西元成兄弟的細川晴元殘部八百人；二陣，平井定武兩千人；三陣，進藤貞治兩千人；四陣，吉田重政一千人，總計五千八百人；
西翼，由三雲定持指揮，分為兩陣：一陣，越中孝俊的高島眾兩千人；二陣，三雲定持的甲賀眾兩千人，合計四千人。
另外，六角義賢率領兩千軍勢駐紮在橫山北麓的龍之鼻，今井肥前守率領五百人留守草野川與姊川交匯處，防備宮部繼潤趁機偷襲。
兩軍隔河相望，相距不過三四百步，雙方的篝火映在河面上，像是兩條金龍在黑暗中對峙。
五月十六日，辰時，天光大亮，姊川的水面在朝陽下泛著金色，兩岸的軍陣中，旗幟獵獵，槍尖如林，上至大將，下至足輕，皆是目光灼灼，蓄勢待發。
中線的六角軍陣中，香西元成全身披掛，頭兜之下，面當之上，一雙赤紅的眼睛閃著兇光。自從細川晴元被刺以來，這個男人活著的唯一理由就是報仇。如今，仇敵就在對岸。
“我先去吧！”
他瞅了進藤貞治一眼，在得到肯定的頷首後，長槍一揮，與香西元廣縱馬衝入姊川，身後的八百人也吶喊著如同一把尖刀般扎向北岸。
“放！”
香西軍渡到中流，熊谷元直的號令如驚雷炸開，北岸的鐵炮隊開始了第一輪鐵炮齊射，白煙瞬間遮蔽了河面。彈丸如暴雨般傾瀉在涉水渡河的香西軍頭上，衝在最前排的軍士像被割倒的稻穗一般成片栽入水中，河水轉眼染成了暗紅色。
“都給我……”
香西元廣話沒說完，身體猛地一頓，一顆彈丸正中眉心，就這麼張著嘴巴一頭栽進了河水裡。
“元廣！”香西元成撕心裂肺地吼了一聲，沒等他從悲痛中緩過神來，第二輪齊射已經到來，他身邊的軍士一個接一個倒下，八百人腳還沒踏上對岸，士氣和攻勢便已為之一挫。
看著這一幕，進藤貞治心頭一沉：“全軍出擊！支援越後守！”
他一聲令下，本部兩千人與平井定武同時向北岸發起衝鋒，試圖以人數優勢迫使鐵炮隊後撤，或者儘快衝到對岸使得鐵炮失去用武之地。
東翼，淺井軍陣中，磯野員昌攥著槍桿的手青筋暴起，鐵炮那“砰砰砰”的聲響像是一記記重錘敲在六角軍的肉體上，也同時敲在了他的心頭——這就是武田軍威名赫赫的鐵炮隊，比焙烙玉和長弓要管用一萬倍！
“看到了麼！”他回頭對身後的軍士吼道，“這就是咱們的後盾！想報佐和山城的仇，現在不衝，更待何時？！”
同樣地，他也率領八百人咆哮著湧入姊川，他的勇猛不輸香西元成，一馬當先殺過河去，長槍如蛟龍出水，直刺蒲生定秀先陣。
蒲生定秀的兵力幾乎是磯野員昌的三倍，可磯野員昌根本不管這些，他已然殺紅了眼，槍尖連挑三人，身後八百淺井軍個個紅著眼珠子跟著往前猛衝，佐和山城的恥辱、番場城的背叛、地頭山的慘敗，所有憋屈在這一刻全變成了殺意。
不過多時，蒲生軍的陣線竟被生生撕開了一個口子。
此戰是蒲生定秀之子蒲生賢秀的初陣，這個十五歲的少年初生牛犢不怕虎，持槍迎上磯野員昌，可兩人只戰了一回合，他便被磯野員昌的力道震得虎口發麻，槍桿脫手，若非後藤賢豐及時率兵趕到，他這顆腦袋怕是留不住了。
海北綱親見磯野員昌大殺特殺，二話不說率部加入戰鬥，淺井久政見敵我比例懸殊，除了令海北綱親前去支援，還向中線的熊谷元直求援，後者當即調小寺政職兩千人支援東翼，六角軍剛剛依靠兵力優勢形成的一波反擊很快就被堵了回去，雙方在南岸陷入了鏖戰。
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