這是他在遼東軍事行動中首次留下明確記載的戰績，也為後續參與抗金埋下伏筆。
萬曆四十七年，後金汗努爾哈赤以“七大恨”告天，正式起兵反明。
攻陷撫順、清河等地，遼東戰局驟然緊張。明廷派楊鎬為遼東經略，調集大軍應對，毛文龍因之前在遼東的軍事經驗，獲加銜“都司”，編入抗金序列。
翌年，薩爾滸之戰爆發，明軍四路出兵卻慘遭大敗，損失兵力四萬餘人，後金乘勝攻陷開原、鐵嶺，遼東東部防線徹底崩潰，明廷被迫啟用熊廷弼為遼東經略，重整遼東防務。
熊廷弼到任後，推行“三方佈置”戰略，以遼東陸路為主體，登萊、天津水師為兩翼，相互策應。
毛文龍被編入瀋陽游擊柏世爵麾下，駐守瀋陽，負責“施放毒藥以防備後金”，同時管轄鐵騎營，在寬奠、靉陽一帶設防。
這段經歷讓毛文龍對遼東東部山區的地形、關隘瞭如指掌，為他後續開展游擊作戰積累了關鍵地理資訊。
泰昌元年十月，熊廷弼因朝廷黨爭去職，離任前專門上疏表彰諸將功勞，為毛文龍請授“實授都司銜”，肯定其防務貢獻。
就在熊廷弼去職前十天，毛文龍在杏山寨擊退來犯敵兵（推測為趁火打劫的蒙古部落），“親斬級一顆，部下斬級二顆”，這是他抗金生涯中首次有明確記錄的戰功，初步展現出實戰能力。
熊廷弼去職後，袁應泰接任遼東經略。
袁應泰雖有治政之才，卻缺乏軍事經驗，上任後更改熊廷弼防禦策略，放鬆對後金的警惕。
天啟元年三月，後金大舉進攻遼東，遼陽、瀋陽相繼陷落，袁應泰自焚殉國，遼東巡撫薛國用等人出逃，遼河以東諸城盡歸後金所有。
毛文龍在鞍山堡的親屬及家丁毛文儀等一百餘名老幼被後金擒殺，另有三百餘名親屬家丁從遼陽逃至遼西廣寧右屯衛，家族遭遇重創。
遼陽陷落後，毛文龍“遭逢不偶，落魄二十餘年”的感慨再度湧上心頭，眼看封侯之志即將破滅，心灰意冷下決意南返，為母親養老送終。
然而，命運的轉折再次出現——他在南返途中偶遇薊遼總督文球。
得知新任遼東巡撫（廣寧巡撫）王化貞正在廣寧訪求武才，重振旗鼓的毛文龍當即改變主意，主動自薦並前往廣寧謁見王化貞。
王化貞正急於組建抗金力量，見毛文龍熟悉遼東地形、且有實戰經驗，便委任其為“練兵游擊”（另有一說稱，時任山東左布政使的沈光祚與王化貞友善，暗中舉薦毛文龍，促成此次任用）。
天啟元年（1621年）五月，王化貞命毛文龍深入遼東淪陷區，伺機奪取鴨綠江口的鎮江堡（今遼寧丹東）——此地是後金連線朝鮮的交通要道，戰略位置重要。
五月二十日，毛文龍率領僅有的197名官兵，乘坐4艘沙船從海上出發，沿遼東半島海岸航行兩個月，避開後金主力，秘密開展戰前準備：一方面聯絡降金漢將楊於渭、單盡忠、劉愛塔等人，策反其反正；
另一方面在遼東沿海諸島安撫流民，收攏失散明軍，“收服一千四百人以上”；
同時擒獲哈店島守將任光先、石城島守將何國用等十人及買牛的女真人二十名，斬獲首級三顆，俘獲後金船隻三隻、銅炮二位、鐵炮四位，初步建立起敵後作戰基礎。
七月十八日，毛文龍率部抵達朝鮮龍川郡彌串堡，與剛從朝鮮求援歸來的遼東生員王一寧會合，共同策劃奇襲行動。
他們通過當地民眾得知，後金鎮江游擊佟養真已派一千餘名女真兵前往雙山救援被襲的後金將領繆一真，鎮江城內兵力空虛，僅餘不滿千人。
七月十九日，鎮江住民徐六向毛文龍密報城內情況，毛文龍當機立斷，派千總陳忠率一百餘名士兵乘夜渡過鴨綠江，與早已被策反的鎮江中軍陳良策裡應外合。
二更時分，明軍突然發難，後金守軍猝不及防，佟養真父子及部下六十餘人被生擒，鎮江堡成功收復，史稱“鎮江大捷”。
鎮江大捷的訊息傳開後，“遠近震動”，遼東東部山區及南四衛（金州、復州、蓋州、海州）民眾紛紛響應，湯站、險山二堡民眾甚至自行綁縛後金守將陳九階、李世科，獻給毛文龍。
毛文龍在鎮江收編遼民四萬餘人，組建軍隊萬人（其中包含原明軍八百人），敵後抗金聲勢一度高漲。
