巴拿馬地區的印第安人對西班牙人殖民統治進行了激烈的反抗。正德十三年（1518年），巴拿馬城周邊的印第安人多次進攻城內的西班牙人，並摧毀了巴拿馬城。但西班牙人憑藉手中優良的武器裝備，對巴拿馬城周邊的印第安人部落採取了各個擊破的策略，殺死了25000多名印第安人，逐漸控制了巴拿馬地峽。
正德十四年（1519年），西班牙巴拿馬總督佩德拉利亞斯殺了巴爾沃亞後，令部下迭戈·德·阿爾位元斯（Diego de Albites）去偵查北部海岸。阿爾位元斯率部到達北海岸後，發現奧傑達建造的諾姆佈雷·德迪奧斯已經破敗不堪，於是他重建了此城。
諾姆佈雷·德迪奧斯城重建後，佩德拉利亞斯下令築一條從諾姆佈雷·德迪奧斯城到巴拿馬城的道路。阿爾位元斯就抓了4000多名印第安人來建造這條長60多公里的道路，築路中，很多印第安人死於飢餓、疾病。當年七月，佩德拉利亞斯視察了建成的道路。西班牙人征服了秘魯地區的印加帝國後，從秘魯運來的金銀財物在巴拿馬卸船，然後用馬匹、人力將貨物沿著這條山路運到諾姆佈雷·德迪奧斯城，再裝船後運往西班牙。隨著諾姆佈雷·德迪奧斯港的不斷繁榮，引起了海盜的眼饞，英國海盜分別於隆慶六年（1572年）、萬曆元年（1573年）劫掠了諾姆佈雷·德迪奧斯港。由於受地形的限制，諾姆佈雷·德迪奧斯港並不是便於防守的地方，在遭到2次大規模的劫掠後，西班牙人於萬曆二十五年（1597年）放火燒了諾姆佈雷·德迪奧斯港，在波託韋洛灣聖瑪利亞·德貝倫城的舊址上建造了一個新的港口，這個港口稱為“聖菲利普·德·波託韋洛”（San Felipe de Puertovelo）。
波託韋洛灣東西長約3公里，南北寬1.5-1.8公里，入口處水深30多米，碼頭處的水深也有14米，是個理想的深水港口，整個港灣能夠同時300艘大帆船。為了加強對港口的防禦，萬曆二十八年（1600年），西班牙人在海灣入口處的南、北海角修築了碉堡，南邊的叫聖地亞哥堡，有5門重炮，北邊的叫聖菲利普堡，有35門重炮。儘管波託韋洛港有2個炮臺守護，但也沒能擋住膽大妄為的海盜的襲擊，萬曆三十年（1602年），英國海盜冒充西班牙人，潛入波託韋洛城內，不僅搶了城內居民的財務，也劫掠了西班牙人的倉庫，共搶走了12萬個金幣。海盜撤走了，西班牙殖民當局為保護城內的居民，在城西南不遠處修築了格羅里亞堡（Santiago de la Gloria），堡壘於（1604年）建成。今後，我們佔領波託韋洛後，可以利用這些堡壘來保護港口、城市。
正德十四年（1519年），西班牙人在修築從諾姆佈雷·德迪奧斯城到巴拿馬城的道路時，佩德拉利亞斯下令重建巴拿馬城。為了護衛巴拿馬城，西班牙人在巴拿馬城靠近海岸邊的小島上（今稱東島、西島，距海岸僅700多米）建造了聖洛倫索（San Lorenzo）要塞。此後，巴拿馬城成了西班牙人入侵秘魯地區的基地。
萬曆二十三年（1595年），西班牙人在巴拿馬北海岸的查格雷斯河（Chagres River，也稱恰格雷斯河）河口也建造了聖洛倫索城堡（Castillo de San Lorenzo，位於今巴拿馬科隆港西12公里），以防止海盜沿查格雷斯河深入內陸劫掠。
西班牙人佔領巴拿馬後，在印第安人貝拉瓜斯部落居住的區域（位於阿蘇埃羅（Azuero）半島北部）發現了大量砂金礦，於是殖民當局抓了很多印第安人開採砂金礦。大量印第安人死於勞役，殖民當局又運來黑人繼續開採砂金礦。
泰昌元年（1620年），西班牙人貝拉瓜斯地區發現了巖金礦，於是建造了聖地亞哥城（Santiago，在巴拿馬城西南190裡）。
不過，由於西班牙人在墨西哥地區、秘魯地區發現了大量金礦、銀礦，因此並不熱衷於在巴拿馬地區找礦，西班牙人在巴拿馬地區開採的金礦、銀礦十分有限。
西班牙人在加強對巴拿馬、墨西哥地區的統治期間，也開始向中美洲地峽中部挺進。
科爾特斯佔領特諾奇提特蘭（即墨西哥城）後，於嘉靖二年（1523年）十一月派手下佩德羅·德·阿爾瓦拉多（Pedro de Alvarado）前往瓜地馬拉地區。
瓜地馬拉以山地為主，西北部有庫丘馬塔內斯山脈（Cuchumatanes Mountains），長400多公里，最高峰海拔3800多米；南部有馬德雷山脈（Madre Mountains），是從墨西哥的恰帕斯地區延伸到瓜地馬拉境內的。瓜地馬拉有30多座火山，主要集中在馬德雷山脈，最高的塔胡穆爾科火山（Tajumulco Volcano）海拔約4220米。北部有佩滕低地，南部沿太平洋有狹窄的平原。北部及東部屬熱帶雨林氣候，南部山地屬亞熱帶氣候。一年分旱季、雨季兩季，四月至九月為雨季，十月至次年三月為旱季，高山地區的氣溫在18℃—28℃之間，其它地方的氣溫比較高，東北部年降水量在2000-3000毫米之間，南部年降水量在500-1000毫米之間。瓜地馬拉曾是瑪雅文化的中心之一，土著人大多是瑪雅人的後裔。
阿爾瓦拉多率120名士兵、173匹馬、4門大炮，首先來到了恰帕斯地區（注：今墨西哥恰帕斯州在西班牙殖民時代屬於瓜地馬拉，1824年才成為墨西哥的一個州），征服了那裡的印第安人後，越過蘇恰特河（Suchiate River，也稱蘇奇亞特河，今為墨西哥、瓜地馬拉的界河）繼續東征，途中遭到了6000基蒂族印第安人的阻擊。印第安人首領特庫姆—烏曼（Tecum Uman）親自指揮作戰，但這些從沒見過馬匹的瑪雅人，根本不知道如何對付敵人的騎兵，也不知道對方射來的“炮彈”是什麼東西？他們很快就被敵人打垮了，特庫姆—烏曼也被西班牙人殺死了。特庫姆—烏曼死後，瑪雅人頓時沒了主心骨，四處逃散，轉入叢林與西班牙人戰鬥。阿爾瓦拉多惱怒之下，對周邊的基蒂族人展開了大屠殺，經3個月的殺戮，有10餘萬基地族人遭到了屠0殺。阿爾瓦拉多的遠征隊在與基蒂族人的戰鬥中也損失了一些人，不得不休整。休整期間，科爾特斯向他派來了援兵。這次，阿爾瓦拉多帶著135名騎兵、120名步兵、400名阿茲特克人（傀儡軍）、4門火炮，向瓜地馬拉高原進軍，很快來到了瑪雅人薩波蒂特蘭（Zapotitlan）城邦國境內。8400多名瑪雅人在領主託託尼卡潘（Totonicap）的帶領下，向入侵者發起了攻擊，但他們沒能擋住100多名西班牙人騎兵的衝擊，在慘敗中逃回了薩波蒂特蘭城（今瓜地馬拉雷塔盧萊烏省聖馬丁·薩波蒂特蘭城）。阿爾瓦拉多打敗託託尼卡潘，率部進攻薩波蒂特蘭城。防禦薩波蒂特蘭城的瑪雅人只有弓箭、長矛，哪能抵得住持有火槍、大炮、利劍的西班牙人的進攻？託託尼卡潘不得不宣佈投降。薩波蒂特蘭城陷落後，附近的很多瑪雅人部落知道抵抗也沒啥用，就紛紛向阿爾瓦拉多表示臣服。
阿爾瓦拉多率部繼續東征，進入了薩馬拉河（Samala River）河谷，這裡是瑪雅人基切城邦國的地盤。當西班牙人沿著河谷前行時，遭到了數千基切人的伏擊。儘管地形不利於西班牙人的騎兵，但西班牙人憑著火力優勢，突破了基切人的防線，進入了對自己有利的平原地區。而基切人不得不放棄主陣地，收縮到下一個山口繼續阻擊入侵者。幾次戰鬥後，雙方在奧林特佩克（Olintepeque）山谷（今瓜地馬拉克薩爾特南戈省奧林特佩克鎮附近）展開了決戰。數萬基切人將西班牙人包圍在了山谷中，西班牙人假裝撤退，把基切人引到了平原地帶。上當的基切人追到平原地帶時，遭到了西班牙人火槍、火炮的打擊。儘管基切人穿著用鹽水泡過的厚棉衣，但他們依然擋不住西班牙人的子彈、炮彈。隨著傷亡的不斷增多，基切人開始恐懼了，而這時西班牙人的騎兵猛衝了過來，徹底擊潰了基切人的勇氣。原本是基切人對西班牙人的包圍戰，變成了西班牙人對基切人的單方面屠殺。此戰，基切城邦國的軍隊全軍覆沒。天亮後，西班牙人佔領了無人防守的基切城邦國的都城謝拉胡伊（Sherahui，歷史上，1902年謝拉胡伊城毀於火山噴發，重建後改名為克薩爾特南戈城（Quetzaltenango），為瓜地馬拉克薩爾特南戈省首府）。阿爾瓦拉多佔領謝拉胡伊城後，對基切人展開了報復。十幾萬基切人，最後只有數千人逃進密林才得以倖存。
基切王國滅亡後，除了尤卡坦半島的瑪雅人外，瓜地馬拉境內其它地區的瑪雅人再也沒敢抵抗西班牙人。儘管他們選擇了投降，但西班牙殖民者也沒有善待他們，不僅把他們視作奴隸，還會故意把天花患者的衣服、碗具等送給印第安人，導致瓜地馬拉境內也爆發了天花，大量印第安人死去。
阿爾瓦拉多佔領瓜地馬拉高原後，來到了阿瓜火山（阿瓜火山），在山腳下發現了一座城的廢墟。當地的瑪雅人告訴阿爾瓦拉多，這座火山叫“瓜地馬拉”（Guatemala，意為“噴火的山”），於是阿爾瓦拉多就在廢墟上建造了一座新城，取名為“聖地亞哥城”，作為殖民者的統治中心。三年後（1527年），由於印第安人不斷襲擊“聖地亞哥城”內的西班牙人，於是殖民當局放棄了“聖地亞哥城”，在謝拉胡伊城南5公里的阿爾莫隆加火山腳下建造了“阿爾莫隆加城”（Almolonga），作為瓜地馬拉都督府。嘉靖二十年（1521年），阿爾莫隆加地區發生了地震，強烈的地震引發了火山噴發，阿爾莫隆加被毀。阿爾莫隆加城重建後，嘉靖二十二年（1543年），西班牙人在阿爾莫隆加城東90公里的阿瓜斯火山（Aguas Volcano）腳下建造了安提瓜瓜地馬拉城（Antihua Guatemala，今也稱舊瓜地馬拉城），然後把瓜地馬拉都督府遷到了這裡。萬曆十八年（1590年），一場地震摧毀了安提瓜瓜地馬拉城，西班牙人重建了城市（歷史上，1717年又一次地震摧毀了安提瓜瓜地馬拉城，於是殖民當局於1775年在安提瓜瓜地馬拉城東北25公里的地方新建了“聖地亞哥城”。1779年，聖地亞哥城作為瓜地馬拉首府後，改名為“新瓜地馬拉城”（La Nueau Guatemala，即今瓜地馬拉城），安提瓜瓜地馬拉城就稱為“舊瓜地馬拉城”）。
