西班牙人殖民委內瑞拉後，接著開始了對哥倫比亞的殖民程序。居住在哥倫比亞的土著人主要是印第安奇布查人，人口在50-300萬人之間，一部分奇布查人在哥倫比亞中部大平原地區建立了穆伊斯卡（Muisca）聯盟。
弘治十二年（1499年），西班牙人羅德里戈·德·巴斯蒂達斯（Rodrigo de Bastidas）率一支遠征隊從西班牙加的斯港（Cadiz，也稱卡地茲）出發，來到了南美洲西北部的瓜希拉（Guajira）半島。
瓜希拉半島呈西南——東北走向深入加勒比海，它的東邊就是委內瑞拉灣。半島長約115公里，寬在45-85公里之間，面積約2.5萬平方公里，西部地勢平坦，氣候乾燥炎熱，年降水量僅350毫米左右，東部以低矮丘陵為主，氣候比較溫潤，最高的馬庫伊雷山（Macuira Hill，也叫馬奎拉山）海拔約860米。瓜希拉半島有豐富的煤炭、黃金、銅、磷酸鹽、油氣資源，土著人很早就在丘陵裡淘金、採銅（紅銅），沿海土著人也在沿海養殖珍珠。
巴斯蒂達斯在瓜希拉半島登陸後，用屠刀征服了當地的印第安部落後，建造了卡波·德·拉維拉城堡（Cabo de la Vela），成了西班牙在哥倫比亞的第一個殖民據點。然後，巴斯蒂達斯以該城堡為基地，沿著海岸向西航行，發現了一條大河的河口，他將此河命名為馬格達萊納河（Magdalena River），將河水注入的海灣命名為烏拉巴灣（Gulf of Uraba）。
馬格達萊納河是哥倫比亞地區的第一大河，發源於上游的馬格達萊納河，流經安第斯山脈在哥倫比亞境內的東科迪勒拉山脈、中科迪勒拉山脈之間的谷地，全長約1500公里，自河口以上可通航約1300公里。
巴斯蒂達斯本想率艦船沿著馬格達萊納河深入內陸，沒想到遭到了沿岸土著人的激烈阻擊。他見沿岸的土著人太多，再冒險深入內陸會付出重大傷亡，就不得不退出馬格達萊納河，沿著哥倫比亞北海岸繼續西行，到達巴拿馬北海岸後，繼續西行，一直航行到巴拿馬與哥斯大黎加邊界處，登陸後擊敗了沿岸的土著人，建造了曼薩尼約城堡（Manzanillo，今屬哥斯大黎加）。他本想繼續沿著海岸西行，但由於乘坐的艦船木殼被船蛆啃食得非常嚴重，不得不令他返航，回到海地島的聖多明各城。巴拿馬地峽
由於哥倫布、巴斯蒂達斯都發現了巴拿馬地峽，巴斯蒂達斯又瓜希拉半島、馬格達萊納河，西班牙王國決定征服巴拿馬、哥倫比亞，批准建立巴拿馬、哥倫比亞殖民地。
正德四年（1509年）十月，發現了委內瑞拉馬拉開波湖的阿隆索·德·奧赫達（也叫奧傑達）率70名西班牙士兵在哥倫比亞北海岸登陸，擊敗了當地的印第安人後，建造了卡塔赫納（Cartagena）城堡。次年，奧赫達以卡塔赫納城堡為基地，率部向內陸挺進，行進了15公里後，來到了圖爾瓦科（Turbaco）地區，他們在這裡遇到了土著人的猛烈攻擊，隨奧赫達深入內陸的領航員胡安·德·拉·科薩（Juan de la Cosa）中毒箭身亡。
胡安·德·拉·科薩曾是哥倫布的製圖師，隨哥倫布多次遠航美洲。弘治十三年（1500年），他將一份完整反映委內瑞拉、哥倫比亞北部海岸的地圖呈給了西班牙王室。弘治十五年（1502年），科薩出版了一份世界地圖，在圖中描繪了發現的新大陸。弘治十六年（1503年），他代表西班牙王室來到葡萄牙的里斯本，抗議葡萄牙人入侵屬於西班牙的新大陸。這次是他最後的一次航行。
科薩被殺後，奧赫達對圖爾瓦科地區的土著人展開了瘋狂的報復，幾乎殺光了當地的土著人，不過奧赫達也付出了沉重代價，遠征隊損失了十分之九，他不得不退回海岸，回到海地島（奧赫達在海地島重整旗鼓後，率部趕往巴拿馬的波託韋洛灣，在聖瑪利亞·德貝倫城上岸後，沿著地峽東海岸向東偵查，在聖瑪利亞·德貝倫城東20公里的地方建造了諾姆佈雷·德迪奧斯城（Nombre de Dios））。
嘉靖四年（1525年），巴斯蒂達斯被西班牙國王授予開發卡波·德·拉維拉到馬格達萊納河之間的地區，於是他再次率遠征隊來到哥倫比亞，在北海岸建造了聖瑪爾塔城堡（Santa Marta）。他在聖瑪爾塔一帶從土著人手裡搶奪了大量黃金，又不願與下屬分享黃金，於是他的副手維拉弗爾蒂（Villafuerte）與五十多個人密謀後，偷襲了巴斯蒂達斯。巴斯蒂達斯深受重傷，準備返回聖多明各城療傷，但由於遇到惡劣氣候，船隻停留在了哈瓦那，最後死在了哈瓦那。
嘉靖十二年（1533年），西班牙船長佩德羅·德·埃雷迪亞（Pedro de Heredia）率遠征隊來到了哥倫比亞卡塔赫納，發現奧赫達建造的卡塔赫納城堡已被土著人摧毀，於是他對周邊的土著人展開了大屠0殺，重建了卡塔赫納城堡。
佩德羅·德·埃雷迪亞以卡塔赫納為基地，也率部殺向了內陸，在圖爾瓦科地區發現了金礦，於是強迫被抓來的印第安人開採砂金礦，並建造了圖爾瓦科鎮（Turbaco）。土著人被殺光後，西班牙人又從非洲運來黑奴開採金礦，圖爾瓦科地區成了西班牙人在哥倫比亞最早開產的金礦區。
嘉靖十四年（1535年），西班牙在哥倫比亞地區設立聖瑪爾塔殖民地，任命貢薩洛·希門尼斯·德·克薩達（Gonzalo Jiménez de Quesada，也稱奎薩達）為地方行政長官。克薩達受命後，率一支900人的遠征隊來到聖瑪爾塔。他在聖瑪爾塔建立殖民地政府機構後，率部來到了馬格達萊納河，沿著河流深入內陸。他們一邊穿越茂密的熱帶雨林，一邊與沿途的奇布查人進行戰鬥，於次年終於來到了哥倫比亞中部的大平原。西班牙人殺光了遇到了土著人後，佔領了奇布查人的一個小城巴卡塔（Bacata，印第安語的意思是“高的田地”）。克薩達宣佈這裡是西班牙人的領土，並將這所小城改名為聖達菲（Santa Fe）。
西班牙人建造了聖達菲城後，以聖達菲城為基地，不斷向南推進，很快佔領了整個哥倫比亞大平原，土著人的穆伊斯卡聯盟徹底崩潰。隨後，西班牙人開始征服生活在東、中、西科迪勒拉山脈的土著人部落。
聖達菲城周邊有寶石礦，以綠寶石（祖母綠）為主，土著人很早就在這裡開採寶石。西班牙人佔領聖達菲地區後，就強迫抓來的土著人替他們開採寶石礦，然後把寶石運回西班牙牟取暴利。
嘉靖十五年（1536年），西班牙人在中科迪勒拉山脈南部的考卡（Cauca）地區發現了幾個金礦，於是建造了波帕揚城（Popayan，今考卡省首府）、卡利城（Cali，今考卡山谷省首府）。同年，西班牙人在馬格達萊納河中游建造了巴蘭卡韋梅哈城（Barrancabermejia），並在城周邊建設了幾個牧場、農場，用於養殖從本土帶來的牛、羊、豬、馬等家畜，種植從歐洲帶來的麥子、大豆、葡萄以及哥倫比亞本地的玉米、土豆、木薯等作物，巴蘭卡韋梅哈城成了西班牙在哥倫比亞地區的畜牧中心、農業中心。
嘉靖十七年（1538年），西班牙在佔領的哥倫比亞地區建立了新格拉納達（Granada）殖民地（注：不是1717年成立的新格拉納達總督區），首府就設在聖達菲城，並將聖瑪爾塔殖民地併入新格拉納達殖民地，任命克薩達擔任第一任新格拉納達殖民地行政長官。克薩達就任後，將聖達菲城進行了擴建，並改名為聖達菲·德·波哥大城（Santa Fe de Bogota）（印第安語的Bacata，即為西班牙語的Bogota。哥倫比亞獨立後，將城名稱為波哥大，並作為首府。1991-2000年，城市名又改回了聖達菲·德·波哥大城，2000年後再次改名為波哥大）。同年，西班牙人在波哥大城東北58公里的地方建內莫孔（Nemocon）城。內莫孔城有個鹽礦，印第安人很早就在這裡利用鹽礦製鹽。西班牙人建造了內莫孔城後，在這裡設立了鹽廠。萬曆二十八年（1600年），西班牙人在內莫孔西南15公里的地方找到了更大的鹽礦，於是建造了錫帕基拉城（Zipaquira），成了哥倫比亞的鹽業中心。
嘉靖十八年（1539年），西班牙人在波哥大城東北130公里的印第安人的溫薩村發現了金礦，於是建造了通哈城（Tunja，今博亞卡省首府）；在波哥大西南230公里的馬格達萊納河畔發現了銀礦，於是建造了內瓦城（Neiva，今烏伊拉省首府）；在波帕揚城西南156公里的地方發現了金礦，於是建造了帕斯托城（Pasto，今納里尼奧省首府）。西班牙人建造通哈城、內瓦城不久，在通哈地區、內瓦地區分別發現了寶石礦、金礦，於是通哈城、內瓦城發展成了繁華的城市（今哥倫比亞在通哈城還開採煤礦、磷礦，在內瓦城也開採煤礦）。
嘉靖十九年（1540年），西班牙人為了方便把掠奪來的金、銀、寶石、藥材、木材運到海邊，就在馬格達萊納河下游建造了蒙波斯（Mompox）中轉港。
嘉靖二十二年（1543年），西班牙在利馬設立秘魯總督區後，新格拉納達殖民地劃歸秘魯總督區管轄。
嘉靖二十四年（1545年），西班牙人在聖瑪爾塔東150公里的阿查河（Rio Hacha）河口發現了砂金礦，於是建造了里奧阿查城（Riohacha，今瓜希拉省首府）。
嘉靖二十九年（1550年），西班牙人在波哥大西偏南135公里的地方發現了銀礦，於是建造了伊瓦格城（Ibague，今託利馬省首府）。同年，西班牙人在哥倫比亞北部佩裡哈山西麓發現了金礦，那裡原為印第安人埃烏巴里斯部落的居住地，西班牙人就在那裡建造了巴耶杜帕爾城（Valledupar，今為塞薩爾省首府）。
嘉靖三十年（1551年），西班牙人在帕斯托城（Pasto）東75公里的地方發現了銅礦，於是建造了莫科阿城（Mocoa，普圖馬約州首府。莫科阿城的銅礦至今還在開採）。
萬曆二十八年（1600年），西班牙人在帕斯托城東南8公里的波0波河（Rio Bobo）河谷發現了砂金礦，於是建造了聖巴巴拉城（Santa Barbara，今為納里尼奧省的一個小城鎮）。
萬曆四十四年（1616年），西班牙人在波哥大城西北240公里的中科迪勒拉山脈西麓的波爾塞河（Porce）河谷發現了砂金礦，於是建造了麥德林城（Medellin，今安蒂奧基亞省首府，為哥倫比亞第二大城市），不久在附近的山區又發現了銀礦。
天啟二年（1622年），西班牙人在巴蘭卡韋梅哈城（Barrancabermejia）東80公里的地方發現了金礦、銀礦，於是建造了布卡拉曼加城（Bucaramanga，桑坦德省首府）。
崇禎二年（1629年），西班牙人在馬格達萊納河入海口建造了巴蘭基亞港（Barranquilla），用於將掠奪的物資快速運回本土。
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